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ELISA實(shí)驗(yàn)操作要點(diǎn)樣本的技巧

2023-11-28 [756]

收集整理三類樣本的技巧: 由于ELISA實(shí)驗(yàn)只能檢測可溶性蛋白質(zhì)的含量,因此要求樣本應(yīng)清晰透明并離心除去沉淀物或懸浮物質(zhì)。為確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性, -20℃或-80℃保存的樣本應(yīng)在1-6個(gè)月內(nèi)完成檢測,4℃保存的樣本在一周內(nèi)完成檢測。此外,樣本中不能含有會(huì)抑制HRP活性的NaN3,否則會(huì)造成假陰性結(jié)果??捎糜贓LISA實(shí)驗(yàn)的樣本一般有血清、血漿、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清以及組織勻漿等。不同樣本類型的預(yù)處理方法也不同。適當(dāng)?shù)臉颖绢A(yù)處理是確保ELISA實(shí)驗(yàn)正確性和準(zhǔn)確性的第一步。這里,我們將介紹幾種不同樣本類型的處理方法。


一、血清
血清是ELISA實(shí)驗(yàn)常-用的樣本,其預(yù)處理也十分簡單。使用無熱原無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液樣本,將試管或離心管在室內(nèi)溫度下放置自然凝固(視室溫環(huán)境10分鐘到2小時(shí)不等)或4℃過夜,分離出血清,(建議傾斜試管或離心管以擴(kuò)大液面的橫截面,使血清能更大程度的分離出來,),2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘),仔細(xì)收集上清,立即進(jìn)行測定,建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存,避免反復(fù)凍融,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

*注意事項(xiàng):

在收集血液樣本的過程中應(yīng)避免溶血,因?yàn)榧t細(xì)胞在溶解時(shí)會(huì)釋放具有過氧化物酶活性的物質(zhì),這種情況下,ELISA實(shí)驗(yàn)中將會(huì)出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng),導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確,出現(xiàn)假陽性結(jié)果。另外,樣本還應(yīng)避免細(xì)菌污染,因?yàn)榧?xì)菌可能含有內(nèi)源性HRP,也會(huì)導(dǎo)致檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

二、血漿
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、肝素鈉、枸櫞酸納或檸檬酸鈉作為抗凝劑,使用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液樣本,采集后30分鐘內(nèi),混合10-20分鐘后,2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘),仔細(xì)收集上清液(血漿),建議在-20℃或-80℃下將收集的血清分裝保存,避免反復(fù)凍融。樣本應(yīng)避免溶血或高血脂。保存過程中如有沉淀形成,使用前應(yīng)該再次離心。

*注意事項(xiàng):

檢測前請仔細(xì)閱讀ELISA試劑盒說明書,查看該試劑盒針對抗凝劑是否有特殊要求。

三、尿液
用無菌管收集,2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘)。仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

四、細(xì)胞培養(yǎng)上清
檢測分泌性的成份時(shí),用無菌管收集。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液吸入離心管中并以2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘),除去細(xì)胞碎片和雜質(zhì),收集上清液備用,樣本保存在-20℃或-80℃,避免反復(fù)凍融,保存過程中如有沉淀形成,使用前應(yīng)再次離心。

五、腦脊液
用無菌管收集,2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,使用前應(yīng)再次離心。(采集大鼠腦脊液)的方法:采集腦脊液時(shí),用濕紗布擦試大鼠頸背部皮膚,剪去背毛暴露皮膚。兩耳連線剪一橫切口(1. 5cm左右),在其中點(diǎn)向尾側(cè)沿皮下剪開2cm,將皮分離兩側(cè),擴(kuò)大視野。緊貼大鼠頭骨依次逐層剪切各肌層,并斷端依次拉向尾側(cè)擴(kuò)大視野。注意,有出血時(shí)用干紗布按壓止血,保持術(shù)口清晰。接近頸后黃韌帶時(shí),小心地用7號注射針頭分離覆蓋的肌肉,暴露寰枕膜。用1ml注射器(針頭用止血鉗使針尖與針體成150度鈍角),針斜面向上,針尖-端近水平刺入蛛網(wǎng)膜下腔,固定針體,緩慢抽取腦脊液,一般采集量為100-200微升。)

六、唾液

用無菌管收集,2-8℃條件離心5分鐘左右(5000-6000轉(zhuǎn)/分鐘),仔細(xì)收集上清,保存過程中如有沉淀形成,使用前應(yīng)再次離心。

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